1992 - Le proteinurie - Michele Rotunno

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1992 - Le proteinurie

Laboratorio Nefrologico Urine


Estratto relazione  "Le proteinurie"
presentata durante il corso dell'Istituto di Ricerche Farmacologiche "Mario Negri"
"La biopsia renale nelle glomerulonefriti con depositi di IgA e nelle nefropatie in età pediatrica e in età avanzata. La malattia ischemica del rene"
Villa Camozzi, Ranica (Bg), 8 aprile 1992

FILTRAZIONE  RENALE:


Nel soggetto normale circa 1.200 ml di sangue al minuto afferiscono ai reni attraverso le arterie renali, suddividendosi ad irrorare, attraverso le arteriole afferenti, circa 2.500.000 nefroni.

Considerando un ematocrito di circa il 50%, il volume/minuto della portata renale plasmatica risulta essere di circa 600 ml, un quinto del quale, circa 120 ml, viene ultrafiltrato attraverso le pareti dei capillari glomerulari, la cui superficie si valuta essere di circa 1,5 metri quadrati.

Se la concentrazione proteica plasmatica è  di circa 80 g/l, nei 180 litri di plasma circolanti, in 24 ore, nel gomitolo glomerulare, destinati alla ultrafiltrazione, transitano circa 14.000 grammi di proteine, che vengono spinte attraverso le finestre endoteliali contro la membrana basale che, se integra, funge da filtro, trattenendole per la maggior parte.

PROTEINURIA:


La proteinuria è il risultato dell’interazione di tre eventi:

Filtrazione glomerulare

Riassorbimento tubulare

Secrezione tubulare

FILTRAZIONE  RENALE:


Le strutture che si frappongono tra le proteine plasmatiche presenti nel capillare glomerulare
e la preurina della capsula del Bowman sono costituite da:

Cellule endoteliali

Membrana basale

Cellule epiteliali


STUTTURA DEL FILTRO  RENALE:


1°)  uno strato di cellule endoteliali che  non presenta una soluzione di  continuità, ma lascia liberi degli  spazi tra le cellule, detti "finestre  endoteliali", la cui funzione pare  essere solo quella di regolare il  flusso si sangue alla sottostante  struttura.

2°)  una membrana basale a sua volta  suddivisa in tre strati:
  uno contiguo alle cellule endoteliali detto "lamina rara interna",
 uno centrale, più elettron denso alla  microscopia elettronica, detto "lamina densa",
 uno più esterno, analogo al primo, detto  "lamina rara esterna".

3°) uno strato di cellule epiteliali che si  appoggiano con le loro digitazioni  citoplasmatiche, i podociti, sulla lamina  rara esterna, determinando tra questi  degli spazi, detti "spazi uriniferi", in cui si  raccoglie l'ultrafiltrato glomerulare.

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La membrana basale risulta costituita da una fitta rete di un particolare tipo di collagene (tipo IV), con funzione di setaccio, permeata da glicoproteine (laminina) e da molecole di proteoglicani e ricca di eparansolfato, che gli conferiscono una carica elettrica di superficie negativa, in grado di respingere le molecole più anioniche.

In situazione di carica elettrica neutra, molecole con diametro di 0,18 nm sono filtrate quasi totalmente, mentre molecole con diametro di 4,2 nm sono trattenute quasi completamente.

Secondo alcuni autori, tra i podociti delle cellule epiteliali, in prossimità della membrana basale, si aggetterebbero delle strutture ponte dette "slit membrane", evidenti in microscopia elettronica, con funzione di ultimo e più selettivo filtro al passaggio delle proteine plasmatiche.


Altri autori dissentono, non riconoscendo a tali strutture un ruolo funzionale, attribuendone l'evidenziazione ad un artefatto legato alla preparazione del tessuto istologico.

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PROTEINE PLASMATICHE

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Il primo gruppo raccoglie le molecole più grandi, con peso molecolare superiore a 100.000, che grazie alle loro dimensioni sono trattenute quasi totalmente da un filtro glomerulare integro, e che quindi non ritroviamo nella preurina dei soggetti sani.

Tra queste segnaliamo come più rappresentative l'alfa2macroglobulina e l'IgG.

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Il terzo gruppo, quantitativamente molto modesto rispetto all'insieme delle proteine seriche, raccoglie le proteine di dimensioni minori, di peso molecolare inferiore a 30.000, in grado di attraversare nella quasi loro totalità un filtro glomerulare anche perfettamente integro, e che insieme ai peptidi di piccole dimensioni, ai soluti ed all'acqua, costituiranno l'ultrafiltrato della preurina raccolto nelle capsule di Bowman.

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Il secondo gruppo raccoglie le proteine di dimensioni intermedie con peso compreso tra 30.000 e 100.000, che vengono anch’esse trattenute per la più parte dal filtro glomerulare integro, ma che in piccola parte  possono attraversarlo, soprattutto le molecole più piccole o più cationiche.

Quando le strutture filtro hanno perso la loro carica negativa di superficie sono soprattutto le proteine di questo gruppo a riversarsi nella preurina.
Tra le proteine del secondo gruppo ricordiamo come più rappresentative  l'albumina e la transferrina.

L’albumina, pur essendo permeabile solo per meno dello 0,4 per 1000, data la sua elevata concentrazione plasmatica, é stata comunque ritrovata nella preurina del soggetto sano nella concentrazione di circa 8 mg/l, ne viene cioè persa nelle 24 ore una quantità di circa 1,5 grammi.

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Ricordiamo come non solo le dimensioni delle proteine incidano sulla loro permeabilità attraverso la membrana basale, ma grande importanza assuma la loro configurazione spaziale e soprattutto la loro carica elettrica di superficie.

Tale aspetto assume particolare importanza per le proteine di taglia medio - piccola.

L'albumina, ad esempio, peso molecolare 66.000, diametro 3,5 nm, molecola fortemente anionica, in condizioni fisiologiche attraversa il filtro glomerulare con una clearance analoga a quella della transferrina, peso molecolare 76.500, ma con minore anionicità, e con clearance molto minore di quella di destrani neutri di analogo peso molecolare.

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DIFFERENTI VALUTAZIONI SULL'ENTITA' DELLE PROTEINE ULTRAFILTRATE


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FILTRAZIONE  RENALE:


In condizioni patologiche, come nelle glomerulonefriti, le proprietà anioniche della membrana basale possono essere in gran parte neutralizzate dal deposito di immunocomplessi, di complemento, di proteine cationiche ed altri fattori, favorendo così il passaggio di proteine altrimenti maggiormente trattenute in funzione della loro carica anionica (ad esempio l'albumina nella proteinuria selettiva).

Nei casi più gravi può venire lesa anche la struttura della membrana basale, con la creazione di spazi che consentono il passaggio anche di molecole con diametro superiore a 4,2 nm (ad esempio l'alfa2macroglobulina o l'IgG nelle proteinurie non selettive).

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RIASSORBIMENTO TUBULARE:


Attraversato il filtro glomerulare, le proteine della preurina, convogliate nel tubulo, subiscono, da parte soprattutto delle cellule del tubulo prossimale, dei processi di riassorbimento, in grado di digerirle e scomporle negli aminoacidi che le costituivano, recuperati poi dalle arteriole reflue e reimmessi in circolo.

La capacità di recuperare le proteine giunte nel tubulo è limitata ad una soglia massima, differente da proteina a proteina (TM di riassorbimento), particolarmente alta per le microglobuline (terzo gruppo), ma che si riduce progressivamente con l'aumento delle dimensioni delle proteine.

Mentre le microproteine del terzo gruppo sono riassorbite quasi totalmente ed in pratica non si ritrovano nell'urina finale, in situazione fisiologica, la piccola quota di albumina filtrata, ad esempio, viene riassorbita solo parzialmente, tanto che può essere ritrovata nell'urina terminale del soggetto sano, sino ad una quantità, nelle 24 ore, di  20-30 mg.

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SECREZIONE TUBULARE:


Il tubulo concorre ad arricchire il contenuto proteico dell'urina finale con la secrezione di proteine quali le mucoproteine di Tham Horsfall (principale costituente dei cilindri ialini), secrete a partire dal tratto ascendente della branca di Henle, immunoglobuline (particolarmente IgA), ed altre mucoproteine e globuline in piccole quantità.

Ad esse si aggiungono le proteine provenienti dalla lisi delle cellule di rivestimento del tratto urinario, per il loro fisiologico turn over.

Nell'uomo, inoltre, vengono secrete piccole quantità di proteine provenienti da prostata e dai dotti seminali.

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PROTEINURIA:


L'analisi delle urine eliminate consente spesso riconoscere la natura della proteinuria e quindi l'eventuale tipo di lesione renale che l'ha provocata

L'elettroforesi proteica su urine (solitamente concentrate ad un livello simile a quello plasmatico) consente di ottenere tracciati che, confrontati con quello serico, sono sufficientemente definiti da permettere di distinguere i tre tipi fondamentali di proteinurie patologiche:
glomerulari, tubulari e da iperafflusso, puri o nelle loro forme miste.

PROTEINURIA GLOMERULARE:


E' caratterizzata dalla presenza in quantità prevalente, come nel siero, di albumina.
Una proteinuria di questo tipo  è secondaria ad alterazioni della permeabilità glomerulare e può essere costituita essenzialmente da albumina e transferrina (proteinuria selettiva), oppure vi possono essere rappresentate, oltre all'albumina che resta prevalente, tutte le bande caratteristiche delle proteine seriche, anche quelle a maggiori dimensioni (proteinuria non selettiva).

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Per la determinazione delle frazioni proteiche urinarie indagate ci si avvale oltre che delle tecniche elettroforetiche, della immuno diffusione radiale, o della immuno nefelometria.

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Si deve a Cameron la proposta di calcolare l'indice di selettività  delle proteinurie glomerulari, facendo ricorso alle clearances sieroproteiche, con riferimento al rapporto tra la clearance della immunoglobulina IgG e quella dell'albumina (si definisce selettiva quando il rapporto è < 0,20;   non selettiva se il rapporto é > 0,20).

Mc Lean ha successivamente proposto un calcolo dell'indice di selettività con riferimento al rapporto tra la clearance della alfa2macroglobulina e quella della transferrina (proteinuria selettiva se l'indice è < 0,010;  proteinuria non selettiva se > 0,015).

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Allo studio della selettività era stato attribuito significato nella diagnosi differenziale di alcuni tipi di glomerulonefrite primitiva:

una proteinuria selettiva è ad es. caratteristica delle glomerulonefriti a lesioni minime, specie in età pediatrica, e di alcune forme iniziali di glomerulo nefrite membranosa.

Una proteinuria non selettiva è in genere presente nelle glomerulo nefriti membranose, in quelle membrano proliferative e nelle glomerulo sclerosi focali.

Una più ampia esperienza ne ha tuttavia ridimensionato il valore semeiotico, tranne che nella diagnostica non bioptica della sindrome nefrosica dell'infanzia da glomerulonefrite a lesioni minime.

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PROTEINURIA GLOMERULARE:


Quantitativamente la proteinuria glomerulare può essere appena maggiore dei limiti fisiologici, ma può anche superare i 40 g die.
Una proteinuria di almeno 3,5 g/24h è arbitrariamente indicata come limite per la definizione di sindrome nefrosica, che si manifesta pienamente quando la perdita di albumina supera la capacità massima di sintesi epatica.

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PROTEINURIA TUBULARE
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E’ espressione di un difettoso riassorbimento tubulare di proteine fisiologicamente filtrate.

Quantitativamente di modesta entità (raramente superano i 2 grammi/24 ore),  sono caratterizzate dalla presenza di proteine a basso peso molecolare (tra 1.500 e 40.000), come l'alfa2-micro globulina, la beta2- micro globulina, il lisozima.

In assenza di insufficienza renale, questo tipo di proteinuria è considerato segno di danno tubulare, e il suo studio trova pertanto applicazione nella semeiotica delle nefriti interstiziali, del rigetto di trapianto renale, del danno da antibiotici e da metalli pesanti,  della sindrome di Fanconi, ed in generale quando si sospetti l'esistenza di una lesione tubulare.

Non è raro che, nelle nefriti interstiziali croniche, con la progressione della malattia, si abbia la comparsa di una proteinuria glomerulare.

La proteinuria può allora avere un aspetto misto glomerulo tubulare.

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PROTEINURIA DA “IPERAFFLUSSO”:


Quando una proteina plasmatica viene prodotta e filtrata in quantità superiori alle capacità massimali di riassorbimento tubulare, si instaura una proteinuria da "iperafflusso".
L'elettroforesi mette allora in evidenza una stretta banda corrispondente alla proteina interessata.
Ne sono un esempio caratteristici la proteinuria di Bence-Jones (catene leggere), l'emoglobinuria, la mioglobinuria e la lisozimuria dei pazienti con leucemia mielocitica.

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Lo studio quantitativo e qualitativo delle proteinurie permette anche di definire la proteinuria fisiologica, e quella ortostatica.

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PROTEINURIA FISIOLOGICA:


Può raggiungere un massimo di 150 mg/24 ore nell'adulto e di 300 mg/24 ore nell'adolescente.

L' albumina può costituire sino al 40% di questa eliminazione; un altro 40-50% è rappresentato da proteine provenienti dall'apparato uropoietico: di esse il 40% circa è costituito della  mucoproteina  di Tamm-Horsfall.

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PROTEINURIA ORTOSTATICA:


Un reperto particolare è quella della cosiddetta "proteinuria ortostatica" che, in quantità fisiologica in clinostatismo, aumenta a livelli francamente patologici dopo che il paziente ha assunto una posizione eretta, assumendo l'aspetto di una proteinuria solitamente glomerulare.

Viene ritenuta generalmente non patologica, anche se alcune indagini hanno invece indicato che essa può essere l'unico segno di una nefropatia che sta decorrendo per il resto senza segni clinici, e che deve quindi sempre essere considerata con notevole attenzione: situazioni di questo tipo sono state accertate per il diabete e per alcune glomerulonefriti.


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DOSAGGIO DELLA PROTEINURIA - NOTE SUI PIU' COMUNI METODI DI DETERMINAZIONE


Le proteine sono una popolazione di molecole molto eterogenee, costituite fondamentalmente da catene di aminoacidi uniti tra loro da legami carbaminici.
L'eterogeneità, oltre che dovuta alla natura e alla sequenza dei 26 differenti aminoacidi che possono costituirle, è anche dovuta al loro numero, in grado di originare sia piccoli peptidi del peso di poche migliaia di daltons, che grosse macromolecole con peso di parecchie centinaia di migliaia o addirittura milioni di daltons.
In forza dei loro restanti radicali aminici e carbossilici non condensati e forze di Van der Waals, tali catene vengono mantenute più o meno spazialmente ripiegate, con frammisti vari altri radicali e ramificazioni di catene molecolari di altra natura (lipidi, glicidi, etc.), evidenziando o mascherando, a seconda del tipo di molecole e dell'ambiente in cui si trovano, parte dei radicali acidi o di quelli basici, conferendo alle macromolecole una natura di colloidi anfoteri.
La concentrazione proteica plasmatica risulta  abbastanza elevata, con un range di variabilità piuttosto contenuto (3-12 g/dL), in un ambiente elettrolitico e di pH abbastanza costante.
Nelle urine, le proteine possono essere rappresentate in maniera ben diversa che nel sangue, ed inoltre il loro range di concentrazione può variare da pochi mg/dL in urine di soggetti sani poliurici a g/dL in urine oliguriche di pazienti con gravi sindromi nefrosiche, in ambienti urinari molto differenti, con possibili ampie variazioni di pH, in presenza di possibili elevate concentrazioni di farmaci, fermentazioni batteriche,  sostanze pigmentanti le urine, contaminazioni, etc.
Nel plasma, pur tra le centinaia di proteine presenti, si é potuto trovare nel punto di unione dei vari aminoacidi costituenti le catene polipeptidiche, i legami carbaminici, un parametro distribuito in maniera abbastanza omogenea, almeno tra le proteine a più elevata concentrazione che, data la loro rilevanza percentuale, rappresentano in tale contesto la quasi totalità del patrimonio proteico.
Tali legami sono in grado di complessarsi con i sali di rame in soluzione alcalina del reattivo del Biureto, sviluppando un colore violetto, di buona stabilità e linearità, di facile lettura colorimetrica e d'intensità proporzionale alla concentrazione proteica.
Tale reattivo, purtroppo non ha una sufficiente sensibilità ai livelli di concentrazione proteica urinaria abituale, e per essere utilizzato, richiede un arricchimento della concentrazione proteica delle urine con metodiche che,  per essere affidabili, comportano un livello di complessità ed un costo non proponibili per una determinazione routinaria della proteinuria.
Al momento, una tale metodica (Doetsch) che utilizza colonnine di resine filtranti le urine e in grado di trattenere le proteine sino a raggiungere una concentrazione tale da consentire una successiva loro eluzione e reazione col reattivo del biureto, è utilizzata solo come metodo di riferimento o in laboratori con limitato numero di richieste.

La ricerca di metodi economici, rapidi e routinari, per la determinazione della proteinuria, ha sinora incontrato ostacoli o per la sensibilità, o per la precisione, o per la riproducibilità o per interferenze con le numerose sostanze riscontrabili in ambiente urinario.
Tra i metodi più utilizzati possiamo ricordarne alcuni facenti parte di quattro differenti principi:

1) errore dell'indicatore
2) metodi turbidimetrici o nefelometrici
3) metodi che utilizzano l'affinità delle proteine a coloranti
4) metodi colorimetrici diretti

1) Nel 1909 Soerenson osservò un fenomeno in soluzioni proteiche definito con il nome di "errore degli indicatori".
Quando in una soluzione avente un dato pH sono presenti delle proteine, un indicatore assume un colore diverso da quello conforme al pH della soluzione priva di proteine; ciò perché le grosse molecole proteiche anioniche interferiscono sulla dissociazione dell'indicatore che si comporta, dal punto di vista delle sue proprietà cromatiche, in modo non più strettamente dipendente dalla concentrazione idrogenionica reale. Quindi, quando un indicatore, in una soluzione a pH noto, commette questo errore cromatico, si può ragionevolmente sospettare in quella soluzione la presenza di molecole proteiche ed effettuarne il dosaggio.
Questo sistema ha avuto tentativi di applicazione pratica anche per la proteinuria, in test in provetta o in test rapidi su vetrino, ma deve il suo grande successo al fatto che è stato possibile concentrare, prima in una compressa (Albutest-Ames) e poi su un pezzetto di carta bibula, i reagenti necessari per riconoscere la presenza di proteine nelle urine.
Nel 1957, ricercatori della Ames misero a punto una cartina reattiva che, immersa per un attimo nell'urina in esame, vira di colore entro pochi secondi dal giallo al verde, se sono presenti proteine, ed in modo tanto più marcato quanto maggiore è la concentrazione di queste.
L'indicatore era il Blu di bromofenolo, sale solubile di fenolo che in acqua sviluppa una colorazione blu. L'aggiunta di un acido trasforma il bromofenolo (tetrabromofenolsulfonftaleina) in fenolo che è giallo, quando il pH della soluzione scende sotto al 4,6. Nella cartina l'indicatore è fortemente tamponato a pH=3, e la cartina risulta gialla, ma vira al verde quando è bagnata da una soluzione contenente proteine, grazie al fenomeno dell'"errore degli indicatori" e l'intensità del viraggio è in rapporto approssimativo alla quantità di proteine presenti.
La sensibilità di tale test è abbastanza elevata raggiungendo livelli di concentrazione proteica intorno ai 15-20 mg/dL, in grado di evidenziare proteinurie di origine sicuramente patologica, ma perdendo quella fascia di proteinurie, pur patologiche, che vengono usualmente denominate "microalbuminuria".
Tale test, comparso sui mercati alla fine degli anni '50, ulteriormente affinato, a cui furono man mano associati in strisce di cartine reattive polivalenti, altri tests facenti parte della comune analisi chimica delle urine, a partire dal glucosio, per proseguire col pH,  l'emoglobina, i corpi chetonici, i pigmenti biliari, l'urobilinogeno, i nitriti, la densità, l'esterasi leucocitarie, ed ora anche il colore, pur rendendosi per l'estrema praticità tuttora insostituibile nelle grosse indagini di screening, si scontra con alcuni limiti:
-le cartine reattive possono dare false positività per le proteine in urine con forte fermentazione ammoniacale e con pH molto alcalino, o in urine contenenti tracce di composti quaternari dell'ammonio.
-le cartine reattive possono dare false negatività per le proteine in urine con concentrazione molto elevata di sali (NaCl, KCl), od in presenza di detergenti.
-le cartine reattive presentano un grado di sensibilità chiaramente diverso per l'albumina e per le globuline, ed in particolare possono fallire nell'evidenziare proteinurie tipo Bence-Jones (nei cui confronti le cartine avrebbero una sensibilità talora inferiore al 10% rispetto all'albumina).

2) Le metodiche turbidimetriche o nefelometriche sfruttano le caratteristiche fisiche delle proteine di poter passare, quali sostanze colloidali, dallo stato naturale di sol a quello di gel.
In particolari condizioni ambientali, infatti, le proteine possono aggregarsi in micelle più grosse e diventare quindi delle sospensioni, provocando una torbidità o un precipitato, che può essere in qualche modo quantizzato.
Il più antico metodo, utilizzato da Dekkers nel 1695, che ha sfruttato questa caratteristica fisica, consta nell'acidificazione e riscaldamento dell'urina, eventi che inducono un passaggio delle macromolecole colloidali proteiche dallo stato disperso di "sol", allo stato aggregato di "gel", evidenziando un intorbidamento, flocculazione o precipitazione, valutabile, in buone condizioni di luce incidente, contro un fondo scuro, con una gradazione d'intorbidamento da poter essere valutata visivamente in modo semiquantitativo nelle tradizionali storiche classi: "negativo", "tracce", "veletto", "velo", "velo netto", "dosabile", con un'ottima sensibilità, inferiore a 10 mg/dL, tale da consentire una differenziazione tra i livelli di proteinuria fisiologica e quelli patologici.
Standardizzando il volume dell'urina e addizionando volumi costanti di differenti soluzioni acide (ac. acetico, ac. picrico, ac. tricloroacetico, ac. solfosalicilico, etc.), misurando o la sedimentazione del precipitato dopo un lasso di tempo o dopo centrifugazione, si e potuto offrire valutazioni quantitative della proteinuria (Esbach, Aufrecht, etc.), oppure misurare fotometricamente l'intensità dell'intorbidamento, sfruttando l'assorbimento di luce delle micelle proteiche (Folin e Denis) o la riflessione di un raggio luminoso incidente su esse (turbidimetria, nefelometria).
Tali metodiche risentono di alcuni limiti:
Le varie soluzioni acide agiscono in maniera differente sulle varie molecole proteiche, originando a parità di concentrazione ponderale, micelle di dimensioni differenti, in grado quindi di sedimentare o di assorbire o riflettere la luce in maniera diversa, con errori talora superiori al 40%.
Inoltre la sensibilità di tali metodi spesso non è sufficiente a misurare con precisione le concentrazioni delle proteinurie vicine al fisiologico.

3) tali metodiche sfruttano il principio utilizzato per differenziare le varie bande proteiche separate sui supporti elettroforetici, con utilizzo di coloranti ad elevata affinità per le proteine (nero d'amido, verde lissamina, rosso ponceau, blu coomassie, etc.).
Dalle iniziali metodiche che comportavano la deposizione di aliquote di urine su supporti porosi quali carta assorbente o supporti cellulosici, colorazione della macchia proteica, lavaggio per allontanare l'eccesso di colorante non legatosi alle proteine e successiva dissoluzione con alcali del supporto con la macchia e misurazione colorimetrica dell'intensità del colorante eluito, si è passati alla precipitazione delle proteine con miscele di acido e colorante, centrifugazione del precipitato proteico a cui rimane fissato il colorante, allontanamento del surnatante col residuo di colorante in eccesso e successiva eluizione con alcali del precipitato e misura del colorante fissatosi alle proteine, ridissolto.
La necessità di isolare le proteine e allontanare il colorante in eccesso comporta rischi di non completa precipitazione o perdita nell' allontanamento del colorante in eccesso, oltre al limite che i vari coloranti, come già segnalato per la quantizzazione delle bande dei tracciati elettroforetici, presentano affinità differenti per le varie molecole proteiche.
Anche la sensibilità è piuttosto scarsa.

4) Ultimamente la ricerca ha reso disponibili metodi più propriamente definibili come direttamente colorimetrici, cioè in grado di consentire la aggiunta, ad un'aliquota del campione di urina, di un reattivo in grado di combinarsi con le proteine, originando un complesso di colore differente, la cui intensità risulta direttamente proporzionale alla concentrazione proteica, in grado di poter essere utilizzati su analizzatori automatici, a basso costo.
Due sono quelli che più rapidamente si sono diffusi e che oggi stanno monopolizzando il mercato.
Un metodo, più sensibile, si basa sull'impiego del complesso rosso di pirogallolo-molibdato, in ambiente acido, in grado di reagire con le proteine per sviluppare in pochi minuti un complesso colorato in blu d'intensità proporzionale alla concentrazione proteica.
L'altro, un po' meno sensibile, utilizza il reagente colorante acido Coomassie Blu Brillante, in grado di formare un complesso proteine-colorante anch'esso di colore blu d'intensità proporzionale alla concentrazione proteica.
Anche per tali metodiche, non identica risulta essere la reattività dell'albumina rispetto alle globuline, ma l'adozione di un additivo quale il SDS (Sodio Dodecil Solfato) al reattivo, in grado di intervenire sulla struttura terziaria delle proteine, ha di molto ridotto la differente cromogenicità delle varie proteine tra loro.
Limiti rimangono tuttavia dovuti al ristretto range di linearità, che obbliga alla diluizione i campioni con concentrazioni proteiche superiori ai 2  g/l, obbligando alla ripetizione del dosaggio dei campioni che eccedono tale valore, con fenomeni, per il rosso pirogallolo, non ancora ben compresi di sottostima legati a forti diluizioni.
Alcuni farmaci possono chelare il molibdato del metodo del rosso pirogallolo, inducendo forti sottostime.
Il blu di commassie, peraltro, presenta inconvenienti per la sua adozionie in alcuni autoanalizzatori per la sua forte adesività alle pareti di tubi e cuvette con effetti di trascinamento non sempre facilmente neutralizzabile.

Da quanto esposto emerge inoltre la difficoltà di scelta degli standard, in quanto uno costituito da albumina poco si presterà a fungere da riferimento per la determinazione di una proteinuria tubulare o di Bence Jones, come pure poco adatto potrebbe essere uno standard costituito da siero umano per una proteinuria glomerulare molto selettiva.
Tutti i problemi evidenziati nell'uso di metodiche di dosaggio globale delle proteine potrebbero essere evitati con l'adozione di specifiche determinazioni immunologiche di singole proteine, in grado di caratterizzare, in funzione delle loro caratteristiche e all'entità del loro risconto nelle urine rispetto a quello plasmatico, il tipo di anomalia funzionale, oltre che con più precisione monitorizzane l'evoluzione.
Al momento, come marker di permeabilità glomerulare, l'albumina, PM = 69.000, anche grazie alla sua rilevanza percentuale sulle altre proteine plasmatiche, ben si presta a metodiche di dosaggio immunologico anche automatizzabile ed a costo contenuto.
Altre proteine, a più elevato peso molecolare, in grado di fornire indicazioni sulla selettività della permeabilità glomerulare (IgG, alfa2M), o microproteine in grado di fornire informazioni sulla funzionalità tubulare (alfa1M, RBP, beta2M), o catene leggere delle immunoglobuline (K, lambda), in grado di evidenziare una proteinuria di Bence-Jones, sono a tutt'oggi, anche in base alla loro concentrazione solitamente inferiore, determinabili solo con metodiche più costose, a tutt'oggi difficilmente proponibili come tests di screening automatizzati routinari.


 
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