2006 - L’esame del sedimento urinario tra artigianato ed automazione: verso un sistema integrato di analisi - Michele Rotunno

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2006 - L’esame del sedimento urinario tra artigianato ed automazione: verso un sistema integrato di analisi

Laboratorio Nefrologico Urine


Relazione presentata al convegno:
"Attualità diagnostico-cliniche in tema di ESAME DELLE URINE e studio della PROTEINURIA"
Torino - 23 giugno 2006
Villa Gualino
Viale Settimio Severo 63, Torino


Nella valutazione del sedimento urinario, l'armamentario a disposizione del laboratorista è stato sinora principalmente costituito dal microscopio tradizionale, utilizzato abitualmente dopo l'esecuzione dell'esame chimico fisico con le cartine.
Da ormai un quarto di secolo è diventato irrinunciabile affiancare alla storica osservazione in campo chiaro quella a contrasto di fase i cui vantaggi nella identificazione degli elementi più diafani, come i cilindri ialini, e nella possibilità di una migliore definizione della morfologia degli elementi cellulari, soprattutto degli eritrociti, sono indiscussi.



I principali elementi tradizionalmente classificati e conteggiati sono qui riassunti:



L'uso di supporti il plastica disposable, simili alle vecchie camere di conteggio, che delimitano cellette per raccogliere volumi standard di sedimento da sottoporre alla osservazione microscopica, hanno spesso soppiantato, soprattutto nei grandi laboratori, i tradizionali vetrini portaoggetto e coprioggetto.



Un campo microscopico a forte ingrandimento (400x) corrisponde all'incirca ad un settore, il quadratino più piccolo della griglia incisa sulla base di ogni celletta.
Se il sedimento è risospeso correttamente, secondo quanto suggerito dai protocolli e dalle linee guida più diffusi, e cioè in 1/20 del volume sottoposto a centrifugazione, gli elementi per microlitro corrispondono a quelli contati in otto settori, cioè in mezzo quadrato grande.

Con l’uso dei vetrini classici, per passare al numero di elementi per microlitro, da quello per campo a forte ingrandimento (400x), a seconda del microscopio in possesso e dell’apertura di campo dell’obiettivo in uso, occorrerà moltiplicare il valore per un fattore compreso solitamente tra 5 e 10.

Ormai già da alcuni anni, è entrato in uso in alcuni laboratori, soprattutto di grandi dimensioni, con un elevato numero di esami da analizzare, affiancando la microscopia tradizionale, uno strumento per la lettura automatizzata anche del sedimento urinario.

Tale strumentazione preleva automaticamente una aliquota dell'urina, senza necessità di pretrattamento, sfruttando la tecnologia dei contaglobuli e dei citofluorimetri, già ampiamente e con successo sperimentata in campo ematologico. La eterogeneità della parte corpuscolata riscontrabile nei campioni di urina e l'ambiente in cui tali elementi possono permanere, per tempi variabili, in condizioni di osmolarità e pH molto più varia, rende sicuramente più difficile una loro corretta automatica classificazione, rispetto a quella degli elementi cellulari del quadro ematologico.







Da poco più di un anno ha iniziato ad essere commercializzato in Italia anche un secondo tipo di strumentazione, con tecnologia completamente diversa, basata sulla acquisizione ed elaborazione automatica d’immagine digitale.




Una camera digitale CCD è in grado di acquisire sino a cinquecento fotogrammi per campione, quando il campo visuale del microscopio è illuminato dal flash di una lampada stroboscopica.

Le immagini risultanti sono isolate, digitalizzate ed inviate ad un computer che funge da processore analitico, che le confronta, sulla base di caratteristiche di
dimensione, forma, contrasto e contenuto, con un archivio storico di oltre 30.000 immagini di riferimento, classificandole in 12 categorie principali:
(RBC, WBC, Aggregati WBC, cilindri ialini, cilindri patologici, epiteli squamosi, epiteli non squamosi, batteri, miceti, cristalli, muco e spermatozoi).



Debbo ringraziare il dott. Pagni che, un anno or sono, mi ha offerto la opportunità, anche se ormai in pensione, di colmare una lacuna in questo settore, consentendomi di sperimentare in contemporanea l’uso di queste due apparecchiature, acquisite in prova nel suo laboratorio.
In qualità di tecnico avevo avuto il privilegio in passato di poter leggere, quotidianamente e per trent’anni, i sedimenti del reparto nefrologico, con il vantaggio, difficilmente riservabile ai laboratoristi dei laboratori centralizzati, di poter concentrare tempo ed attenzione ad un ristretto numero di campioni da analizzare giornalmente, spesso ricchi di elementi significativi e con la possibilità di conoscere in tempo reale la situazione clinica dei pazienti da cui provenivano.
E’ comprensibile come difficilmente un laboratorista che tutti i giorni si trovi a dover smaltire 2-3-400 anonimi esami urine, in un grosso laboratorio, riesca a trovare le motivazioni ed il tempo per i dovuti approfondimenti con la microscopia tradizionale.
Queste nuove strumentazioni automatiche potrebbe essere finalmente la soluzione a questo annoso problema, ma lascio queste considerazioni eventualmente alla discussione.



Un breve flash sulla correlazione relativa all’ematuria con la strumentazione attualmente disponibile.



Due soli flash anche sulla correlazione relativa alla cilindruria, ricordando come la strumentazione automatica tenti di classificare i cilindri suddividendoli in due sole categorie, cil. ialini e cil. patologici, con una indicazione di positività legata ad una soglia personalizzabile dall’operatore, differente per le due popolazioni, ma che non consente una distinzione nelle classi in cui sono solitamente classificati i cilindri all'osservazione microscopica tradizionale, che consente una loro quantizzazione in funzione di ogni singola tipologia rilevata.





Nel caso della cilindruria il confronto ha messo in evidenza una scarsa correlazione

I riflessi pratici di questa inaffidabilità rappresentano un problema aperto

Scarso o trascurabile in caso di cilindruria ialina, l’interesse degli alti tipi di cilindri è in genere notevole e non risolto dalla strumentazione automatica.

Trattandosi in genere di elementi di accompagnamento questa limitazione, che speriamo superabile, può però essere accettata, purché la si tenga presente e si eseguano controlli visivi dei campioni particolarmente ricchi, o con indicazioni a un secondo livello.

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In una carrellata di immagini di reperti fotografati con la microscopia tradizionale, vorrei, oltre che sottolineare, ancora una volta, quante siano le importanti informazioni che possano essere rilevate da un'attenta osservazione del sedimento, commentare quali di queste possano essere colte dalla strumentazione automatica attuale e quante invece possano andare perdute, se si rinuncia alla integrazione con la microscopia tradizionale.



La lettura del sedimento urinario, oltre a fornire una informazione semiquantitativa delle emazie presenti nelle urine, consente spesso, dalla valutazione della loro morfologia, di sospettare la sede della lesione emorragica.


- Emazie ben conservate, impilate, a pigmentazione conservata
- Emazie ben conservate, talora a margini raggrinziti ma integri



- Emazie ben conservate, a margini raggrinziti, spinose



- Emazie ben conservate, tipo sferocita


Emazie ben conservate, tendenzialmente monomorfe, lenticolate, sferocitiformi o spinose, senza evidenza di alterazioni della membrana cellulare, orientano verso una forma di ematuria a rapida estrinsecazione, quale generalmente riscontrabile nelle forme urologiche



- Emazie mal conservate, polimorfe e depigmentate



- Emazie mal conservate, polimorfe e depigmentate, con fenomeni di estrusione



- Emazie mal conservate, con marcato polimorfismo e  con fenomeni di estrusione (acantociti)



- Emazie mal conservate, con fenomeni di estrusione di emoglobina che si distacca in goccioline libere o adese a formare catenelle


Emazie mal conservate, polimorfe, a margini cellulari alterati, con fenomeni di frammentazione o di estrusione emoglobinica, orientano verso una forma di ematuria a più lenta estrinsecazione, caratteristica prevalente delle lesioni renali, principalmente delle glomerulonefriti
.

Questa valutazione morfologica degli eritrociti nelle urine può essere facilitata da una osservazione del sedimento urinario al microscopio con contrasto di fase.

Dall'inizio degli anni '80 l’osservazione al contrasto di fase ha avuto una rapida diffusione con abbondante letteratura riportante casistiche di ottima correlazione tra morfologia delle emazie e sede delle lesioni, tanto da indurre molti a suggerire una refertazione del sedimento urinario con definizione delle emazie in "glomerulari" o "non glomerulari
".

Successive casistiche hanno attenuato tale entusiasmo, riportando frequenti casi equivoci di ematurie sicuramente glomerulari con presentazione di emazie prevalentemente ben conservate, e frequenti casi di ematurie sicuramente urologiche con presentazione di emazie prevalentemente alterate.

Rimane comunque confermata l'utilità di tale osservazione in una elevata percentuale di casi con quadri assolutamente caratteristici e non equivoci, che la strumentazione automatica non è al momento in grado di fornire.
La tecnologia citofluorimetrica può al più fornire indicazioni di polimorfismo delle emazie dalla osservazione sullo scattergram della nuvola riconducibile alle emazie e dalla percentuale della distribuzione dimensionale.
La tecnologia di acquisizione d'immagini digitale consente una valutazione a schermo delle immagini acquisite, ma attualmente con una risoluzione ancora troppo bassa per il riconoscimento dei particolari invece visibili con la microscopia tradizionale, soprattutto se corredata dal contrasto di fase.

Una buona osservazione del sedimento urinario consente inoltre di evidenziare altri elementi di accompagnamento alla ematuria che possono confermarne la natura renale o urologica e, all'osservatore attento, di evitare di confondere le emazie con altri elementi.



- Emazie ben conservate, tipo sferocita, con presenza di miceti che potrebbero essere scambiati per estrusioni di emoglobina da emazie mal conservate



- Emazie con fenomeni di estrusione
- Bollicine d'aria incluse tra i vetrini



- Cilindro ialino con emazie incluse o adese



- Cilindro ialino con inclusione di emazie con estrusioni



- cilindro ialino cellulare con inclusa emazia ben conservata



- cilindro ialino eritrocitario

- cilindro granulo ematico




- granulociti con nucleo polilobato ben evidente


- leucociti ed emazie ben distinguibili
- piccoli leucociti che potrebbere essere scambiati per emazie grinze


- granulociti in disgregazione


- granulociti istiocitiformi, con citoplasma dendritico


- granulociti fagocitanti miceti


- cilindro ialino con incluse cellule tubulari, granulociti ed un probabile linfocita


- due linfociti accanto ad un granulocita
- cilindro ialino con adeso un ammasso di linfociti




- epiteli squamosi con a fianco più piccoli epiteli transizionali o renali


- epiteli squamosi, batteri ed emazie mestruali
- tappeto di epiteli squamosi ed epiteli urinari superficiali






- epiteli tubulari  a confronto, nel riquadro, con epiteli uroteliali degli strati profondi
- epiteli tubulari colonnari e rotondeggianti


- frammento di epitelio tubulare
- epiteli tubulari aggregati



Molto più scarso l'apporto diagnostico dell'osservazione standard del sedimento urinario per quanto riguarda la ricerca di cellule di natura tumorale, talora evidenziabili anche senza colorazioni specifiche.

L'osservazione a contrasto di fase consente di rilevare, in cellule polimorfe con sproporzione nucleo - citoplasma, i dettagli del nucleo ed i suoi nucleoli, non altrettanto ben visibili in campo chiaro, consentendo, ad osservatori particolarmente esperti, talora di sospettare la natura neoplastica.


- cellule vescicali abnormi


Tali reperti debbono essere sempre confermati da più approfondite ricerche citologiche, solitamente effettuate con la colorazione di Papanicolaou, su campioni di urine raccolti con opportuni conservanti, in quanto alterazioni morfologiche di cellule urinarie dovute a cause tossiche, degenerative o flogistiche, possono talora indurre in grossolani errori.

Gli elementi sovrapresentati ben difficilmente possono essere riconosciuti dalla attuale strumentazione automatica per la lettura dei sedimenti





I cilindri sono costituiti da materiale precipitato o conglutinato su una matrice organica, in prevalenza costituita dalla mucoproteina di Tamm-Horsfall, nei lumi tubulari distali e nei collettori.

La precipitazione dei cilindri è favorita dalla presenza di urine concentrate e acide.

A pH alcalino la matrice ialina non si forma o si dissolve.


- istologico renale con tubuli intasati dal materiale ialino costituente i cilindri





- strie di muco, cilindroidi e cilindri ialini, molto meglio visibili in contrasto di fase che in campo chiaro



- strie di muco, cilindroidi e cilindri ialini, molto meglio visibili in contrasto di fase che in campo chiaro


- cilindri granulosi



- cilindri granulosi

Una cilindruria ialina è riscontrabile nel soggetto normale, specie dopo sforzo, disidratazione, esposizione a freddo intenso, nello scompenso cardiaco e nella iperpiressia.

Una cilindruria occasionale granulosa a piccolo diametro e a piccoli granuli è possibile in situazioni patologiche rapidamente reversibili e nel soggetto normale.

Una cilindruria granulosa persistente ha sempre significato patologico, specie se a grossi granuli.


- cilindri cerei



- cilindri con inclusioni cellulari



- cilindri eritrocitari e granuloematici



- cilindri epiteliali



- cilindri con inclusioni di epiteli in degenerazione lipidica e corpi ovali grassi



- cilindro cereo con inclusioni di granulociti


- cilindri con linfociti inclusi ed adesi


- cilindro ialino con inclusioni lipidiche



- cilindro infarcito di gocce lipidiche
- la luce polarizzata consente di evidenziare con le croci di malta le gocce piu grandi e più ricche di colesterolo



- cilindro ialino con inclusioni di cristalli di ossalato di calcio monoidrato (whewellite)
- cilindro ialino con inclusioni di cristalli di ossalato di calcio diidrato (wedellite)



- cilindro granuloematico
- cilindro cereo granuloematico e cellulare



- cilindri pigmentati (pigmentazione granuloematica, emoglobinica, mioglobinica o da farmaci?)
- cilindri emosiderinici e granuli di emosiderina (nel riquadro conferma con colorazione dell'emosiderina in blu di prussia con aggiunte di ferrocianuro)



- cilindro ialino granulo cellulare pigmentato di bilirubina (pigmentazione anche degli elementi cellulari liberi)
- cilindro ialino granulo cellulare pigmentato di bilirubina, di medio piccolo diametro, incluso in cilindro di diametro maggiore, formatosi in un collettore in un momento sucessivo di minore sofferenza epatica



- cilindro di piccolo diametro
- cilindro formatosi in un tubolo allo sbocco in un collettore a diametro maggiore, che ne prende l'impronta



- cilindri formatisi alla confluenza di tubuli collettori di diametro differente
- cilindri a largo diametro


Anche le informazioni ricavate dalla osservazione dei cilindi in microscopia tradizionale, evidenziate dalle immagini esposte, difficilmente possono essere raccolte dalla sola lettura automatizzata del sedimento urinario.





- cristalli di ossalato di calcio diidrato (wedellite)
- cristalli di ossalato di calcio monoidrato (whewellite)



- urati amorfi che circondano cristalli di acido urici (nel riquadro fosfati amorfi)
- cristalli di urato acido



- cristalli esagonali di acido urico (indicato dalla freccia una forma esagonale regolare che potrebbe essere scambiata per cistina)
- cristalli di 2-8 diidrossiadenina



- cristalli di fosfato ammonio magnesiaco esaidrato (struvite) nella classica forma a coperchio di bara
- cristalli di fosfato ammonio magnesiaco esaidrato (struvite) in forme meno frequenti (indicato dalla freccia forma esagonale regolare che anch'essa potrebbe essere scambiata per cistina)


- cristalli esagonali di cistina
- cristalli a placche di colesterina


Anche per il corretto riconoscimento dei cristalli, come mostrato dalle pur poche immagini illustrate, l'uso della microscopia tradizionale resta insostituibile.

Come per gli altri elementi corpuscolati, con la stumentazione automatizzata basata sulla aquisizione di immagini digitali, rimane indispensabile la valutazione degli elementi a video, per una loro identificazione e classificazione, pur col limite di una definizione ridotta rispetto a quella microscopica tradizionale, opzione peraltro assente con la strumentazione basata sul principio citofluorimetrico.

Per entrambe le strumentazioni, cristallurie ad elementi di piccole dimensioni possono essere, dai due software di riconoscimento strumentale, erroneamente attribuite alle emazie.

 
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